Laporan Pewarnaan Bakteri
Deskripsi Singkat
Laporan Praktikum Hari/Tgl : Kamis, 30-04-2015
Mikrobiologi Pangan PJ Praktikum : CC. Nurwitri, DAA
Asisten Praktikum : Embun Novita, Amd
PEWARNAAN BAKTERI
Kelompok 8 / B P1
Alfina Syaikani (J3E114047)
Widiawati (J3E114020)
Dania Syamsunita (J3E214099)
SUPERVISOR JAMINAN MUTU PANGAN
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2015
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pewarnaan merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan untuk membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negative. Kedua jenis bakteri dibedakan berdasarkan komponen penyusun dinding sel. Selain tiu, pewarnaan spora dapat membedakan ada/tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difensial. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna Kristal violet, larutan iodium,larutan alcohol (pemucat), dan zat pewarna tandingannya (counter strain) berupa zat warna safranin. Hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negative berwarna merah.
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu jenis pewarna untuk mewarnai organisme. Zat warna yang akan digunakan umumnya bersifat alkalin. Pewarnaan sedehana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll),dari bahan-bahan lainnya yang diwarnai (Hadiutomo, 1990). Hasil pewarnaan sel dengan metoda ini menghasilkan satu warna. Zat warna yang dapat digunakan untuk pewarnaan ini adalah biru metilen (30-60 detik) berwarna biru, Kristal violet (10 detik) berwarna ungu dan fuchsin karbol (5 detik) berwarna merah.
Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan clostridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal (letak spora diantara ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) (Dwidjoseputro, 2005).
Kapsula adalah bagian dari sel berupa lapisan tebal, lebih kental, dan melekat kuat pada dinding sel. Kapsul dapat berfungsi sebagai pelindung terhadap lingkungan yang kurang menguntungkan, sebagai cadangan makanan, dan pengikat antar sel dalam satu koloni. Adanya kapsul melindungi bakteri dan mekanisme kerja sel pagosit inang (sel yang mencerna benda asing) dan kapsul tersebut menambah kemampuan bakteri untuk menginfeksi Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan sutu pewarnaan khusus. Salah satu pewarnaan kapsula bakteri adalah dengan pewarnaan bakteri (Irianto, 2006).
Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah melatih mahasiswa agar mampu melakukan pewarnaan sederhana, gram, spora, dan kapsul. Melatih mahasiswa agar mampu mengidentifikasi bakteri gram positif, gram negative, dan bakteri spora.
BAB II
METODOLOGI
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu mikroskop, bunsen, jarum ose, gelas objek, gelas penutup, mikroskop, cawan petri, batang gelas, berbentuk u atau v, kertas saring, hot plate, beker glass, korek api, kertas hisap, kertas lensa, dan tissue/lap. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu Biakan murni (nata de coco), gliserol, Bacillus muda (staphylococcus surius), Bacillus tua, Bakteri Acetobacter xylinum, Staphylococuc aeureus, kristal violet, iodium,safranin, etanol 70%, aquades, CuSO4 20%, minyak emersi, xylol, methilen blue, malachite green.
Prosedur Kerja
Pewarnaan Gram
Kultur diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisPreparat diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanLarutan iodine gram (Mordant) diteteskan di atas preparat dan ditunggu selama 1 menit Kultur diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisPreparat diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanLarutan iodine gram (Mordant) diteteskan di atas preparat dan ditunggu selama 1 menit
Kultur diambil
dengan menggunakan
jarum ose
secara aseptis
Preparat diambil
dengan menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Larutan iodine gram
(Mordant) diteteskan
di atas preparat dan
ditunggu selama 1 menit
Kultur diambil
dengan menggunakan
jarum ose
secara aseptis
Preparat diambil
dengan menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Larutan iodine gram
(Mordant) diteteskan
di atas preparat dan
ditunggu selama 1 menit
Kelebihan larutan iodine dibuanglalu dibilas dengan air mengalirKelebihan larutan iodine dibuanglalu dibilas dengan air mengalirAlcohol 95% diteteskan di atas preparat dan didiamkan 20 detikAlcohol 95% diteteskan di atas preparat dan didiamkan 20 detik
Kelebihan larutan
iodine dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Kelebihan larutan
iodine dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Alcohol 95%
diteteskan di
atas preparat
dan didiamkan 20 detik
Alcohol 95%
diteteskan di
atas preparat
dan didiamkan 20 detik
Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Kelebihan larutan safranin dibuanglalu dibilas dengan air mengalirKelebihan larutan safranin dibuanglalu dibilas dengan air mengalirPreparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,
Kelebihan larutan
safranin dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Kelebihan larutan
safranin dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDiteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Suspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisPewarnaan Sederhana
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Staphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisStaphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Bacillus Tua diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisBacillus Tua diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisPewarnaan Spora
Bacillus Tua diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Bacillus Tua diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diratakan dengan gelas obyek hingga keringDiratakan dengan gelas obyek hingga kering
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diratakan
dengan
gelas obyek
hingga kering
Diratakan
dengan
gelas obyek
hingga kering
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Pewarna Safraninditeteskan di ataspreparat dan ditungguselama 1 menit Pewarna Safraninditeteskan di ataspreparat dan ditungguselama 1 menit Sisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanDilakukan fiksasi diatas penangas airhingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi diatas penangas airhingga terbentuk film tipis.Diteteskan pewarna malachitegreenDiteteskan pewarna malachitegreen
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Pewarna Safranin
diteteskan di atas
preparat dan ditunggu
selama 1 menit
Pewarna Safranin
diteteskan di atas
preparat dan ditunggu
selama 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Dilakukan fiksasi
diatas penangas air
hingga terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
diatas penangas air
hingga terbentuk
film tipis.
Diteteskan
pewarna
malachite
green
Diteteskan
pewarna
malachite
green
Pewarnaan Kapsul
Staphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisStaphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDiteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menit
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,CuSo4 20% dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanCuSo4 20% dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanDiamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.CuSo4 20% diteteskandi atas preparat dan ditungguselama 1 menit CuSo4 20% diteteskandi atas preparat dan ditungguselama 1 menit Sisa Pewarna dibuang lalu dibilas denganair mengalirSisa Pewarna dibuang lalu dibilas denganair mengalirDiteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
CuSo4 20% dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
CuSo4 20% dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
CuSo4 20% diteteskan
di atas preparat
dan ditunggu
selama 1 menit
CuSo4 20% diteteskan
di atas preparat
dan ditunggu
selama 1 menit
Sisa Pewarna
dibuang lalu
dibilas dengan
air mengalir
Sisa Pewarna
dibuang lalu
dibilas dengan
air mengalir
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Pembuatan Slide Culture
Pada cawan petri tersebut disimpan batang penahan berbentuk segitigaPada cawan petri tersebut disimpan batang penahan berbentuk segitigaCawan petri sterildisiapkan dan di dalam nya diberikertas saring sterilCawan petri sterildisiapkan dan di dalam nya diberikertas saring steril
Pada cawan petri
tersebut disimpan
batang penahan
berbentuk segitiga
Pada cawan petri
tersebut disimpan
batang penahan
berbentuk segitiga
Cawan petri steril
disiapkan dan
di dalam nya diberi
kertas saring steril
Cawan petri steril
disiapkan dan
di dalam nya diberi
kertas saring steril
Slide culturediinkubasiselama 1 mingguSlide culturediinkubasiselama 1 mingguDi atas batang Penahan segitiga diletakkan sebuahgelas objek steril.Di atas batang Penahan segitiga diletakkan sebuahgelas objek steril.
Slide culture
diinkubasi
selama 1 minggu
Slide culture
diinkubasi
selama 1 minggu
Di atas batang
Penahan segitiga
diletakkan sebuah
gelas objek steril.
Di atas batang
Penahan segitiga
diletakkan sebuah
gelas objek steril.
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objekDiberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.
Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
diberi aga
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup sterilKapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup sterildiblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup steril
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup steril
diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi. Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi.
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi.
Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Tabel 1. Hasil Pengamatan
Jenis Pewarnaan dan Mikroba
Pembesaran
Gambar
Deskripsi (Bentuk, sel, miselium, warna, dll
Pewarnaan Sederhana
Bacillus (tua)
1000x
Basil, berantai dan berwarna ungu
Slide Culture kontaminan Nata de Coco
400x
Spongiofor, miselium
Pewarnaan Gram
Bacillus ( muda )
1000x
Basil, berantai dan berwarna ungu.
Pewarnaan spora, Bacillus (tua)
1000x
Basil, berantai, berwarna ungu
Pewarnaan Kapsul, Acetobacter xylinum
1000x
Coccus kecil diselubungi warna biru
Pembahasan
1.Pewarnaan Spora
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan terperangkap di dalam spora dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua (safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).
Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang ukurannya bulat lonjong memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini identik dengan bakteri garam positif sebab bakteri yang di lihat dominan violet, di dalam koloni ini juga terdapat spora yang berwarna hijau. Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu. Contoh bakteri garam positif yaitu Bacillus subtilis, Stepcoccus sp lactis; Staphylococcus aureus. Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Contoh bakteri garam negatif: Corynebacterium diphteri,Eschercia coli dan Salmanela thypora (Sutedjo,1991).
Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif yaitu bakteri garam negatif ialah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna crystal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah jika diamati dengan mikroskop. Disisi lain bakteri garam negatif seperti Eschercia coli memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan luarnya, bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan lapis atau endotoksin). Disisi lain, bakteri gram positif akan berwarna ungu perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram (Pelczar, 2007).
Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam endospora. Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh kesalahan praktikan dalam melakukan fiksasi yang kurang tepat seperti fiksasinya terlalu lama yang dapat mengakibatkan bakteri mati, serta penggunaan kertas hisap yang tidak tepat dapat menyebabkan suspensi yang ada di gelas objek menjadi hilang akibat gesekan kertas hisap tersebut.
2. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan kapsula bakteri secara langsung (pewarnaan positif).
Pada kegiatan praktikum ini, pewarnaan secara langsung dilakukan dengan menggunakan kristal violet dan CuSO4. Pewarnaan secara langsung ini dimaksudkan untuk mewarnai sel-sel bakteri yang diamati. Apabila bakteri mempunyai kapsul, maka dalam pengamatan sel bakteri akan tampak berwarna ungu dan diselubungi oleh kapsul yang berwarna biru muda. Kristal violet merupakan larutan yang yang mempunyai kromophore atau butir pembawa warna yang bermuatan positif (memiliki kation) sedangkan muatan yang berada di sekeliling bakteri bermuatan negatif (memiliki anion), sehingga terjadi adanya tarik menarik antara kedua ion tersebut. Hal inilah yang menyebabkan bakteri berwarna ungu. Dan terbentuknya warna biru muda pada kapsula disebabkan karena kapsula menyerap CuSO4 20%. Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum ini, dapat diketahui bahwa hasil yang didapat tidak sesuai dengan ciri ciri kapsul. Hal ini ditandai dengan tidak adanya warna biru muda yang menyelubungi sel bakteri yang berwarna ungu, selain itu ukuran sel terlalu besar sehingga tidak dapat dikatakan bakteri. Tidak terbentuknya warna biru muda disekeliling sel bakteri dapat diketahui bahwa tidak ada yang menyerap CuSO4, seperti yang kita ketahui yang dapat menyerap CuSO4 adalah kapsul. Menurut Tarigan (1988), fungsi kapsul adalah untuk melindungi tubuh dari kekeringan sementara dengan mengikat molekul-molekul air, dapat memblok perlekatan bakteriofag, serta sebagai anti fagositosik. Selanjutnya Hastuti (2002) menjelaskan bahwa pada beberapa jenis bakteri, adanya kapsula ini menunjukkan sifat virulen.
3. Pewarnaan Gram
Pada praktikum pewarnaan gram dilakukan pada bakteri Bacillus. Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri ke dalam bakteri negatif dan bakteri positif. Bacillus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Bacillus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Bacillus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37ºC dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
4. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya .Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Namun dalam praktikum ini jenis pewarna yang dipakai hanya pewarna Kristal violet saja. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh sel bakteri berukuran sangat kecil, berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai dengan warna biru.
5. Slide Culture
Pada praktikum kali ini, praktikan membuat slide culture dengan kontaminan nata de coco. Langkah awal yaitu disiapkan sebuah cawan Petri steril yang di dalamnya diberi kertas saring steril yang dipotong bundar. Pada cawan Petri tersebut diletakkan batang penahan, dan di atas batang penahan tersebut diletakkan sebuah objek gelas steril beserta penutupnya yang kemudian diinokulasi. Untuk membuat koloni menempel pada gelas objek sebelumnya diberi agar. Kemudian sedikit koloni diambil dengan menggunakan ose dan dioleskan pada gelas objek. Setelah beberapa hari diinkubasi dalam suhu kamar, slide dapat diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran rendah sampai tinggi, lalu diidentifikasi.
Hasil pengamatan slide kultur bakteri Acetobacter xylinum yang didapat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000 x yaitu terlihat hifa yang membentuk miselium semu. Pada bakteri ini terdapat bagian-bagian yaitu sporangium yang berbentuk bulat yang berisi spora. Sporangium akan pecah bila spora telah matang. Sporangiofor adalah hifa yang tumbuh tegak lurus substrat yang berfungsi sebagai batang.
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum kali ini dapat disimpulkan bahwa pewarnaan digunakan untuk membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis dan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel dan berwarna merah. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Pewarnaan spora dapat membedakan ada/tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel. Pewarnaan kapsul ialah metode pewarnaan diferensial yang dikhususkan untuk melihat bagian kapsul dari suatu bakteri. Pewarnaan kapsul merupakan gabungan antara pewarnaan sederhana dan pewarnaan negatif. Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.
Saran
Saran dari praktikum kali ini yaitu alat dan bahan yang digunakan dapat berfungsi dengan baik misalnya Mikroskop, diharapkan Mikroskop dapat dipakai dengan baik. Selain itu diharapkan praktikan lebih berhati-hati saat pengamatan dengan mikroskop sehingga preparat tidak pecah atau rusak karena jarak antara lensa terlalu dekat dengan preparat.
Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Gramedia
Hadiutomo, Ratna S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama : Jakarta.
Hastuti, T. 2002. Kesehatan Dan Keselamatan Kerja. Cetakan Pertama. Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Jakarta
Lay,W.B.1994.Analisa Mikroba di Laboratorium.EdisiI.Jakarta : PT.Raja Grafindo Persada
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. (4 Mei 2015).
Pelczar,Michael J. ECS. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta. UI Press
Simarmata, Diana. 2013. Laporan Pewarnaan Gram dan Pewarnaan.
Sutedjo,M,M. , Kartasapoetra, A, G. ,Sastroatmodjo, S.Mikrobiologi Tanah,1996. PT. Rhineka Cipta,Jakarta
Tarigan, J., 1988,Pengantar Mikrobiologi mum.Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Jakarta.
Deskripsi
Laporan Praktikum Hari/Tgl : Kamis, 30-04-2015
Mikrobiologi Pangan PJ Praktikum : CC. Nurwitri, DAA
Asisten Praktikum : Embun Novita, Amd
PEWARNAAN BAKTERI
Kelompok 8 / B P1
Alfina Syaikani (J3E114047)
Widiawati (J3E114020)
Dania Syamsunita (J3E214099)
SUPERVISOR JAMINAN MUTU PANGAN
PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2015
BAB I
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pewarnaan merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan untuk membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negative. Kedua jenis bakteri dibedakan berdasarkan komponen penyusun dinding sel. Selain tiu, pewarnaan spora dapat membedakan ada/tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difensial. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna Kristal violet, larutan iodium,larutan alcohol (pemucat), dan zat pewarna tandingannya (counter strain) berupa zat warna safranin. Hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negative berwarna merah.
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu jenis pewarna untuk mewarnai organisme. Zat warna yang akan digunakan umumnya bersifat alkalin. Pewarnaan sedehana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll),dari bahan-bahan lainnya yang diwarnai (Hadiutomo, 1990). Hasil pewarnaan sel dengan metoda ini menghasilkan satu warna. Zat warna yang dapat digunakan untuk pewarnaan ini adalah biru metilen (30-60 detik) berwarna biru, Kristal violet (10 detik) berwarna ungu dan fuchsin karbol (5 detik) berwarna merah.
Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genus bacillus dan clostridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisi secara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal (letak spora diantara ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) (Dwidjoseputro, 2005).
Kapsula adalah bagian dari sel berupa lapisan tebal, lebih kental, dan melekat kuat pada dinding sel. Kapsul dapat berfungsi sebagai pelindung terhadap lingkungan yang kurang menguntungkan, sebagai cadangan makanan, dan pengikat antar sel dalam satu koloni. Adanya kapsul melindungi bakteri dan mekanisme kerja sel pagosit inang (sel yang mencerna benda asing) dan kapsul tersebut menambah kemampuan bakteri untuk menginfeksi Lapisan kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan sutu pewarnaan khusus. Salah satu pewarnaan kapsula bakteri adalah dengan pewarnaan bakteri (Irianto, 2006).
Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah melatih mahasiswa agar mampu melakukan pewarnaan sederhana, gram, spora, dan kapsul. Melatih mahasiswa agar mampu mengidentifikasi bakteri gram positif, gram negative, dan bakteri spora.
BAB II
METODOLOGI
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu mikroskop, bunsen, jarum ose, gelas objek, gelas penutup, mikroskop, cawan petri, batang gelas, berbentuk u atau v, kertas saring, hot plate, beker glass, korek api, kertas hisap, kertas lensa, dan tissue/lap. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu Biakan murni (nata de coco), gliserol, Bacillus muda (staphylococcus surius), Bacillus tua, Bakteri Acetobacter xylinum, Staphylococuc aeureus, kristal violet, iodium,safranin, etanol 70%, aquades, CuSO4 20%, minyak emersi, xylol, methilen blue, malachite green.
Prosedur Kerja
Pewarnaan Gram
Kultur diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisPreparat diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanLarutan iodine gram (Mordant) diteteskan di atas preparat dan ditunggu selama 1 menit Kultur diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisPreparat diambil dengan menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanLarutan iodine gram (Mordant) diteteskan di atas preparat dan ditunggu selama 1 menit
Kultur diambil
dengan menggunakan
jarum ose
secara aseptis
Preparat diambil
dengan menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Larutan iodine gram
(Mordant) diteteskan
di atas preparat dan
ditunggu selama 1 menit
Kultur diambil
dengan menggunakan
jarum ose
secara aseptis
Preparat diambil
dengan menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Larutan iodine gram
(Mordant) diteteskan
di atas preparat dan
ditunggu selama 1 menit
Kelebihan larutan iodine dibuanglalu dibilas dengan air mengalirKelebihan larutan iodine dibuanglalu dibilas dengan air mengalirAlcohol 95% diteteskan di atas preparat dan didiamkan 20 detikAlcohol 95% diteteskan di atas preparat dan didiamkan 20 detik
Kelebihan larutan
iodine dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Kelebihan larutan
iodine dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Alcohol 95%
diteteskan di
atas preparat
dan didiamkan 20 detik
Alcohol 95%
diteteskan di
atas preparat
dan didiamkan 20 detik
Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Kelebihan larutan safranin dibuanglalu dibilas dengan air mengalirKelebihan larutan safranin dibuanglalu dibilas dengan air mengalirPreparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,
Kelebihan larutan
safranin dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Kelebihan larutan
safranin dibuang
lalu dibilas
dengan air mengalir
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDiteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Suspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisPewarnaan Sederhana
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Staphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisStaphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Bacillus Tua diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisBacillus Tua diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisPewarnaan Spora
Bacillus Tua diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Bacillus Tua diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diratakan dengan gelas obyek hingga keringDiratakan dengan gelas obyek hingga kering
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diratakan
dengan
gelas obyek
hingga kering
Diratakan
dengan
gelas obyek
hingga kering
Diamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Pewarna Safraninditeteskan di ataspreparat dan ditungguselama 1 menit Pewarna Safraninditeteskan di ataspreparat dan ditungguselama 1 menit Sisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanSisa pewarna dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanDilakukan fiksasi diatas penangas airhingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi diatas penangas airhingga terbentuk film tipis.Diteteskan pewarna malachitegreenDiteteskan pewarna malachitegreen
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Pewarna Safranin
diteteskan di atas
preparat dan ditunggu
selama 1 menit
Pewarna Safranin
diteteskan di atas
preparat dan ditunggu
selama 1 menit
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Sisa pewarna dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Dilakukan fiksasi
diatas penangas air
hingga terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
diatas penangas air
hingga terbentuk
film tipis.
Diteteskan
pewarna
malachite
green
Diteteskan
pewarna
malachite
green
Pewarnaan Kapsul
Staphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisStaphylococus Aeureus diambil Diambil denganmenggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisSuspensi diratakan di preparat menggunakan jarum ose secara aseptisDilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Dilakukan fiksasi hingga terbentuk film tipis.Diteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menitDiteteskan kristal violet dan ditunggu 1 menit
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Staphylococus Aeureus diambil
Diambil dengan
menggunakan jarum
ose secara aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Suspensi diratakan di
preparat menggunakan
jarum ose secara
aseptis
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Dilakukan fiksasi
hingga
terbentuk
film tipis.
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Diteteskan kristal
violet dan
ditunggu 1 menit
Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,Preparat dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap,CuSo4 20% dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanCuSo4 20% dibilasdengan air mengalir pada posisi preparat yang dimiringkanDiamati di bawah mikroskop.Diamati di bawah mikroskop.CuSo4 20% diteteskandi atas preparat dan ditungguselama 1 menit CuSo4 20% diteteskandi atas preparat dan ditungguselama 1 menit Sisa Pewarna dibuang lalu dibilas denganair mengalirSisa Pewarna dibuang lalu dibilas denganair mengalirDiteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Diteteskan larutan safranin di atas preparat, lalu dibiarkan selama 20 detik.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.Sisa alkohol dibuang dan dibilas dengan air mengalir.
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
Preparat dikeringkan
dengan hati-hati
dengan kertas
penghisap,
CuSo4 20% dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
CuSo4 20% dibilas
dengan air mengalir
pada posisi preparat
yang dimiringkan
Diamati
di bawah
mikroskop.
Diamati
di bawah
mikroskop.
CuSo4 20% diteteskan
di atas preparat
dan ditunggu
selama 1 menit
CuSo4 20% diteteskan
di atas preparat
dan ditunggu
selama 1 menit
Sisa Pewarna
dibuang lalu
dibilas dengan
air mengalir
Sisa Pewarna
dibuang lalu
dibilas dengan
air mengalir
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Diteteskan larutan
safranin di atas
preparat, lalu
dibiarkan selama 20 detik.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Sisa alkohol
dibuang dan
dibilas dengan
air mengalir.
Pembuatan Slide Culture
Pada cawan petri tersebut disimpan batang penahan berbentuk segitigaPada cawan petri tersebut disimpan batang penahan berbentuk segitigaCawan petri sterildisiapkan dan di dalam nya diberikertas saring sterilCawan petri sterildisiapkan dan di dalam nya diberikertas saring steril
Pada cawan petri
tersebut disimpan
batang penahan
berbentuk segitiga
Pada cawan petri
tersebut disimpan
batang penahan
berbentuk segitiga
Cawan petri steril
disiapkan dan
di dalam nya diberi
kertas saring steril
Cawan petri steril
disiapkan dan
di dalam nya diberi
kertas saring steril
Slide culturediinkubasiselama 1 mingguSlide culturediinkubasiselama 1 mingguDi atas batang Penahan segitiga diletakkan sebuahgelas objek steril.Di atas batang Penahan segitiga diletakkan sebuahgelas objek steril.
Slide culture
diinkubasi
selama 1 minggu
Slide culture
diinkubasi
selama 1 minggu
Di atas batang
Penahan segitiga
diletakkan sebuah
gelas objek steril.
Di atas batang
Penahan segitiga
diletakkan sebuah
gelas objek steril.
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objekDiberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.
Di atas batang penahan diletakkan sebuah gelas objek steril beserta penutupnya.
Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
Diberi agar PDA agar medium Nata de coco menempel pada gelas objek
diberi aga
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup sterilKapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup sterildiblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup steril
Kapang kemudian diinkubasi pada kedua blok agar dan ditutup oleh penutup steril
diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
diblok agar steril ±1 cm2 dipotong dari medium nata de coco dalam cawan petri steril dan diletakkan di atas gelas objek
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi. Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi. Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi.
Setelah itu, slide diamati dengan menggunakan mikroskop dan diidentifikasi.
Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Tabel 1. Hasil Pengamatan
Jenis Pewarnaan dan Mikroba
Pembesaran
Gambar
Deskripsi (Bentuk, sel, miselium, warna, dll
Pewarnaan Sederhana
Bacillus (tua)
1000x
Basil, berantai dan berwarna ungu
Slide Culture kontaminan Nata de Coco
400x
Spongiofor, miselium
Pewarnaan Gram
Bacillus ( muda )
1000x
Basil, berantai dan berwarna ungu.
Pewarnaan spora, Bacillus (tua)
1000x
Basil, berantai, berwarna ungu
Pewarnaan Kapsul, Acetobacter xylinum
1000x
Coccus kecil diselubungi warna biru
Pembahasan
1.Pewarnaan Spora
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan utama akan terperangkap di dalam spora dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan yang kedua (safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).
Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang ukurannya bulat lonjong memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini identik dengan bakteri garam positif sebab bakteri yang di lihat dominan violet, di dalam koloni ini juga terdapat spora yang berwarna hijau. Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu. Contoh bakteri garam positif yaitu Bacillus subtilis, Stepcoccus sp lactis; Staphylococcus aureus. Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Contoh bakteri garam negatif: Corynebacterium diphteri,Eschercia coli dan Salmanela thypora (Sutedjo,1991).
Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif yaitu bakteri garam negatif ialah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna crystal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah jika diamati dengan mikroskop. Disisi lain bakteri garam negatif seperti Eschercia coli memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan luarnya, bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan lapis atau endotoksin). Disisi lain, bakteri gram positif akan berwarna ungu perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram (Pelczar, 2007).
Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam endospora. Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh kesalahan praktikan dalam melakukan fiksasi yang kurang tepat seperti fiksasinya terlalu lama yang dapat mengakibatkan bakteri mati, serta penggunaan kertas hisap yang tidak tepat dapat menyebabkan suspensi yang ada di gelas objek menjadi hilang akibat gesekan kertas hisap tersebut.
2. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan kapsula bakteri secara langsung (pewarnaan positif).
Pada kegiatan praktikum ini, pewarnaan secara langsung dilakukan dengan menggunakan kristal violet dan CuSO4. Pewarnaan secara langsung ini dimaksudkan untuk mewarnai sel-sel bakteri yang diamati. Apabila bakteri mempunyai kapsul, maka dalam pengamatan sel bakteri akan tampak berwarna ungu dan diselubungi oleh kapsul yang berwarna biru muda. Kristal violet merupakan larutan yang yang mempunyai kromophore atau butir pembawa warna yang bermuatan positif (memiliki kation) sedangkan muatan yang berada di sekeliling bakteri bermuatan negatif (memiliki anion), sehingga terjadi adanya tarik menarik antara kedua ion tersebut. Hal inilah yang menyebabkan bakteri berwarna ungu. Dan terbentuknya warna biru muda pada kapsula disebabkan karena kapsula menyerap CuSO4 20%. Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum ini, dapat diketahui bahwa hasil yang didapat tidak sesuai dengan ciri ciri kapsul. Hal ini ditandai dengan tidak adanya warna biru muda yang menyelubungi sel bakteri yang berwarna ungu, selain itu ukuran sel terlalu besar sehingga tidak dapat dikatakan bakteri. Tidak terbentuknya warna biru muda disekeliling sel bakteri dapat diketahui bahwa tidak ada yang menyerap CuSO4, seperti yang kita ketahui yang dapat menyerap CuSO4 adalah kapsul. Menurut Tarigan (1988), fungsi kapsul adalah untuk melindungi tubuh dari kekeringan sementara dengan mengikat molekul-molekul air, dapat memblok perlekatan bakteriofag, serta sebagai anti fagositosik. Selanjutnya Hastuti (2002) menjelaskan bahwa pada beberapa jenis bakteri, adanya kapsula ini menunjukkan sifat virulen.
3. Pewarnaan Gram
Pada praktikum pewarnaan gram dilakukan pada bakteri Bacillus. Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri ke dalam bakteri negatif dan bakteri positif. Bacillus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Bacillus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Bacillus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37ºC dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
4. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya .Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Namun dalam praktikum ini jenis pewarna yang dipakai hanya pewarna Kristal violet saja. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh sel bakteri berukuran sangat kecil, berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai dengan warna biru.
5. Slide Culture
Pada praktikum kali ini, praktikan membuat slide culture dengan kontaminan nata de coco. Langkah awal yaitu disiapkan sebuah cawan Petri steril yang di dalamnya diberi kertas saring steril yang dipotong bundar. Pada cawan Petri tersebut diletakkan batang penahan, dan di atas batang penahan tersebut diletakkan sebuah objek gelas steril beserta penutupnya yang kemudian diinokulasi. Untuk membuat koloni menempel pada gelas objek sebelumnya diberi agar. Kemudian sedikit koloni diambil dengan menggunakan ose dan dioleskan pada gelas objek. Setelah beberapa hari diinkubasi dalam suhu kamar, slide dapat diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran rendah sampai tinggi, lalu diidentifikasi.
Hasil pengamatan slide kultur bakteri Acetobacter xylinum yang didapat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000 x yaitu terlihat hifa yang membentuk miselium semu. Pada bakteri ini terdapat bagian-bagian yaitu sporangium yang berbentuk bulat yang berisi spora. Sporangium akan pecah bila spora telah matang. Sporangiofor adalah hifa yang tumbuh tegak lurus substrat yang berfungsi sebagai batang.
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum kali ini dapat disimpulkan bahwa pewarnaan digunakan untuk membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negative. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis dan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel dan berwarna merah. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Pewarnaan spora dapat membedakan ada/tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel. Pewarnaan kapsul ialah metode pewarnaan diferensial yang dikhususkan untuk melihat bagian kapsul dari suatu bakteri. Pewarnaan kapsul merupakan gabungan antara pewarnaan sederhana dan pewarnaan negatif. Kapsul tidak memiliki aktifitas yang besar terhadap bahan-bahan cat basa. Beberapa kapsul cepat rusak oleh gangguan mekanis atau larut bila dicuci dengan air. Karena kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya, maka tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama.
Saran
Saran dari praktikum kali ini yaitu alat dan bahan yang digunakan dapat berfungsi dengan baik misalnya Mikroskop, diharapkan Mikroskop dapat dipakai dengan baik. Selain itu diharapkan praktikan lebih berhati-hati saat pengamatan dengan mikroskop sehingga preparat tidak pecah atau rusak karena jarak antara lensa terlalu dekat dengan preparat.
Daftar Pustaka
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Gramedia
Hadiutomo, Ratna S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama : Jakarta.
Hastuti, T. 2002. Kesehatan Dan Keselamatan Kerja. Cetakan Pertama. Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Jakarta
Lay,W.B.1994.Analisa Mikroba di Laboratorium.EdisiI.Jakarta : PT.Raja Grafindo Persada
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. (4 Mei 2015).
Pelczar,Michael J. ECS. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta. UI Press
Simarmata, Diana. 2013. Laporan Pewarnaan Gram dan Pewarnaan.
Sutedjo,M,M. , Kartasapoetra, A, G. ,Sastroatmodjo, S.Mikrobiologi Tanah,1996. PT. Rhineka Cipta,Jakarta
Tarigan, J., 1988,Pengantar Mikrobiologi mum.Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Jakarta.
Lihat lebih banyak...
Komentar
